kras小分子抑制剂研究进展 -米乐m6平台

hunter等和chen等报道的sml系列化合物能与kras的gtp酶活性位点发生不可逆共价结合，很好地解决了竞争性可逆抑制剂对 gtp酶活性位点结合能力弱的问题。sml系列化合物是一种gdp类似物，含有一个从β磷酸盐延伸出来的亲电弹头，经过迈克尔反应加到cys12上，形成一个稳定的硫醚键,研究发现，sml 阻止了 kras与下游效应物raf的结合。但该类化合物作为竞争性不可逆抑制剂在ras不同亚基之间的选择性仍然是化合物结构设计的挑战。该类抑制剂的代表化合物sml-8-73-1（1，图2）在1 mmol·l -1 gdp/gtp环境中，与 kras g12c 的结合率超过 95%，抑制肺癌细胞 h358 增殖的 ic 50 值为26.6 μmol·l -1 。

kras突变主要发生在gly12，gly13和gln61残基上，而这3个氨基酸处于kras蛋白发挥gtp酶活性的催化位点，突变后对kras蛋白的gtp酶活性影响显著，因此找到可与kras的gtp酶活性位点结合的小分子抑制剂，对抑制kras异常激活意义重大。早期的 kras抑制剂开发思路即是寻找能竞争性结合kras的gtp酶活性位点的鸟苷类似物，但由于ras各亚型中gtp酶结构域的序列和结构几乎相同，各亚型之间很难做到高选择性；且kras与gdp/gtp的亲和力常数达pmol水平，而细胞中 gtp浓度在 mmol水平，小分子药物很难对kras进行竞争性结合；同时kras蛋白表面缺少有利于小分子结合的空腔，使基于gtp酶活boumelha等于2021年在美国癌症研究学会上报道了化合物rm-032，该分子可与 kra sg12c和亲环蛋白 a 共价结合，抑制 kras g12c肿 瘤 细胞中 ras通路信号传导和细胞增殖。rm-032具有口服利用度高、体外对细胞增殖抑制明显的特点，但其详细结构未见报道。

1.2.1 作用于kras g12c突变型

2013年，janes等首次报道了利用小分子共价结合kras g12c突变体的可行性。对于krasg12c型的突变，突变产生的半胱氨酸（c12）残基与相邻的组氨酸95（h95）残基产生了一个易于靶向的狭窄口袋开关ⅱ口袋，可提供稳定的药物-蛋白质相互作用位点。小分子通过不可逆共价结合于此“口袋”，可将kras g12c锁定在非活性状态，从而影响肿瘤细胞的增殖扩散，而不破坏未突变kras 的正常功能。由于开关ⅱ口袋的发现和不可逆共价结合技术的发展，使得直接靶向kras抑制剂的研发重新成为热点，直接靶向kras的小分子不可逆共价抑制剂不断被报道。

安进公司研发的amg510（2，图3）是第一个进入临床研究的kras共价抑制剂，在30 min内可缓慢地将kras-tgp转换为kras-gdp。amg510分子与 kras g12c共结晶（图 4）显示，其母核喹唑啉酮占据 kras 开关ⅱ口袋，丙烯酰胺部分与c12形成共价键，吡啶环的取代基（异丙基）与y96，h95和q99紧密接触，很大程度上填充了h95残基的侧链旋转产生的口袋。此时，kras蛋白gtp酶活性位点无法再容纳3个磷酸基，与gtp的结合力大大降低，同时也会阻碍gef催化gtp替换gdp的过程，将kras g12c锁定在结合gdp的非活性状态，阻止肿瘤细胞增殖扩散.

阿达格拉西布（adagrasib，mrtx849）是另一种可口服的 kras g12c 小分子共价抑制剂（3，图3），具有与amg510相同的作用机制。该化合物的上市申请已于2022年2月15日向美国食品药品管理局（fda）提交，用于治疗kras g12c突变且此前接受过至少1次全身治疗的非小细胞肺癌患者。

国内外其他公司基于开关ⅱ口袋作用机制设计开发的kras g12c共价小分子抑制剂化学结构见图 3，其体外细胞增殖抑制活性见表 1。其中贝达、信达、先声、劲方药业和首药控股的研制的该类化合物细胞增殖抑制活性ic 50 值达几十nmol水平，其他公司的小分子抑制剂紧随其后，均表现出良好的抑制活性。

1.2.2 作用于kras g12d突变型

kras g12d突变也是人类恶性肿瘤中最主要的变异之一，研究可抑制kras g12d的小分子抑制剂对治疗恶性肿瘤具有极高的价值。清华大学张永辉团队报道的针对kras g12d突变的抑制剂th-z816（18，图5），具有与kras g12c抑制剂截然不同的结构和作用机制。对 th-z816 与kras g12d 的共晶结构研究发现，kras g12d化合物结合口袋也由开关ⅱ口袋（红色）、p-环（蓝绿色）和α2-螺旋（绿色）等蛋白结构组成（图6a）。th-z816的萘基部分深深嵌入开关ⅱ口袋中，与残基val9，met72，phe78，gln99，ile100和val103形成疏水相互作用，同时还与残基 his95，glu62，gly60 和 asp12 之间也有 4 对极性相互作用（图6b）。突变体中asp12的羧酸基在生理条件下脱去质子后带负电荷，与碱性的、带正电荷的哌嗪基团形成正、负电荷相互吸引的盐桥。这种正、负电荷之间的强盐桥相互作用类似于建筑结构中的榫卯结构，使蛋白与小分子药物像榫和卯一样牢固连接（图 6c）。这种结合也“挤压”了 kras g12d 的gtp酶活性位点，使其结合gtp的能力大大降低，从而抑制kras因突变产生的过度活化，这一发现为kras g12d抑制剂的开发提供了很好的思路。相较针对kras g12c突变开发的不可逆共价抑制剂，盐桥在提供牢固的结合力的同时也使这种结合具有可逆性。因此，以这种作用机制开发的抑制剂属于变构位点的可逆抑制剂。

在张永辉团队之前，最早报道的kras g12d可 逆 抑 制 剂 是 mirati therapeutics 公 司 研 发 的mrtx1133（19，图 5），其具有与 th-z816 相同的哌嗪结构，并与其作用机制类似。该化合物对kras g12d 的 抑 制 具 有 选 择 性 和 可 逆 性 ，对kras 野生型细胞无影响。在胰腺癌和结直肠癌的动物荷瘤模型上均显示出对 kras依赖性信号的持续剂量依赖性抑制，且在 3 mg·kg -1 水平即可有效抑制 g12d 突变型移植瘤生长，但至今未见其进入临床研究的报道。我国恒瑞医药披露，其针对 kras g12d 开发的抑制剂 hrs-4642 注射液于 2022 年 7 月 26 日获批临床，无疑成为国内 kras g12d 抑制剂药物研发的先行者，但未见其化合物结构的报道。同时，国内加科思公司的化合物 20（图 5）和南方医科大学陈建军团队的化合物 kd8（21，图 5）也是含哌嗪结构的抑制剂。

kessler等开发的bi-2852（22，图7a），结合在 kras上的开关ⅰ口袋和开关ⅱ口袋间的特殊口袋中。其与 kras的活性或非活性形式结合的亲和力达nmol水平。晶体结构研究发现，bi-2852与kras的活性形式kras-gtp结合时，开关ⅰ口袋（图7b浅绿色）口袋和开关ⅱ口袋（图7b浅红色）口袋相较于与非活性形式kras-gdp结合时均显著减小。通过这种特定的结合方式，不但阻断kras-gdp 与 sos1 之间的相互作用，也抑制kras-gtp与其下游效应物raf和pi3k之间的相互作用，这导致 gdp 到 gtp 的交换被抑制，gap催化的gtp到gdp的交换也被抑制，从而可很好地抑制nci-h358肿瘤细胞增殖 。bi-2852最终虽未能成药，但证明了开关ⅰ口袋和开关ⅱ口袋确实是可能的结合位点，给抑制kras药物的开发提供更多可能。

protac技术是利用小分子化合物诱导靶向蛋白降解的技术。protac分子是一种双功能小分子，一端结合靶蛋白的配体，另一端结合e3泛素连接酶的配体，结构中 2 个配体之间通过连接子（linker）相连。其在体内可将靶蛋白和e3酶拉近，使靶蛋白被打上泛素标签，然后通过泛素 — —蛋白酶体途径降解靶蛋白。bond等报道了（23，图 8），它是第一个能够降解内源性 krasg12c的 protac 分子，lc-2 用阿达格拉西布弹头与 kras g12c 共价结合，并招募 e3 连接酶vhl，从而诱导快速而持续的 kras g12c 降解，导致纯合和杂合 kras g12c 细胞系中 mapk 信号通路的抑制；在 nci-h2030 细胞中，lc-2 很好地 诱 导 了 内 源 性 kras g12c 降 解 ，ic 50 值 为（0.59±0.20）μmol·l -1 。protac 技术虽起步较晚，但因其在药物开发上的独特优势而备受关注，加之kras抑制剂研究日益广泛，该类降解剂的报道也不断涌现。li等报道的化合物kp-14（24，图8）与lc-2具有类似的结构，其对nci-h358细胞增殖的ic 50 值为17.41 μmol·l -1 。

2 间接作用于kras的抑制剂

kras在胞内信号传递通路中处于关键位置，通过阻断 kras上、下游信号转导，可开发出多种间接抑制kras的小分子化合物。主要包括：影响kras 在细胞中正常分布小分子抑制剂，抑制kras 释放 gdp 的 sos1 抑制剂，抑制 kras 脱磷酸化的 shp2 抑制剂和抑制kras调控的下游信号通路的抑制剂等。

2.1.1 法尼基转移酶抑制剂

法尼基化是存在于真核细胞中的异戊二烯化修饰形式，它可以修饰蛋白并使其锚定到胞膜上。实体瘤增殖与转移中常见法尼基转移酶的参与，且与转移酶的活性有关。通过抑制法尼基转移酶的活性，可以阻断 kras蛋白法尼基修饰，切断其与 细 胞 膜 结 合 路 径 ，从 而 抑 制 肿 瘤 细 胞 的 增殖。替吡法尼（tipifarnib，r115777）（25，图 9）是选择性抑制法尼基转移酶的小分子抑制剂，基于乳腺癌和肾癌的适应证的开发处于临床ⅱ期试验阶段，基于胰腺癌适应证的开发处于ⅲ期临床试验阶段。

2.1.2 pde-δ δ靶向降解剂

kras为了到达质膜，其法尼基化的高变区与pde-δ的穿梭因子结合。cheng等报道了第一类 pde-δ 降解物化合物 26（图 9）。该化合物与pde-δ结合，并有效地诱导pde-δ降解，最终诱导kras突变体sw480和hct116细胞的凋亡，并在体内、外对kras突变的结直肠癌细胞均表现出明显的抗增殖能力，对 sw480 细胞增殖的 ic 50 值为（8.0±2.7）μmol·l -1 ，对hct116细胞增殖的ic 50 值为（8.0±3.6）μmol·l -1 。

sos1蛋白是一种在细胞中广泛表达的调控蛋白，作为信号通路中的关键蛋白，其在细胞内许多信号转导通路中起重要调控作用。sos1是gef和ras的激活剂，可在变构位点结合kras-gtp，从而增强gef功能，构成正反馈调节，其缺失或其gef 功能特异性基因失活已被证明会降低携带kras突变的肿瘤细胞存活率。研发有效且选择性sos1 抑制剂将与 mek 抑制剂协同作用，从而在kras驱动癌症中产生强大且持续的通路阻断和良好的抗肿瘤功效，成为kras小分子抑制剂的研究方向。

bi-3406（27，图9）是一种高效、高选择性、高口服生物利用度的小分子sos1抑制剂。该抑制剂可和 sos1 催化结构域结合，从而阻断 sos1 与kras之间相互作用。bi-3406可抑制肿瘤生长，在mia-paca-2 荷瘤小鼠中，每日 2 次给予 bi-340650 mg·kg -1 与曲美替尼（trametinib）0.125 mg·kg -1 ，可在长达10 h内持续抑制肿瘤细胞的增殖；该化合物代谢约24 h后，mia-paca-2肿瘤的erk磷酸化水平恢复到基础水平。由于 sos1 在所有肿瘤类型中均表达，其抑制剂 bi-3406 可广泛应用于kras突变引起的肿瘤治疗。

shp2磷酸酶由ptpn11基因编码，参与多种细胞致癌信号级联反应，是第一个报道的致癌磷酸酶。shp2可直接使kras脱磷酸化，增强其与效应蛋白raf的结合，从而激活下游mek/erk信号通路。tno155（28，图9）是诺华制药公司通过优化吡嗪类变构开发的shp2抑制剂，其对shp2的ic 50 为0.011 mmol·l -1［60］ ，tno155可抑制ras/raf/erk 信号通路，并且在小鼠和大鼠中的口服生物利用度分别为 78% 和 86% 。jab-3068（29，图9）是由加科思制药公司开发的shp2的小分子抑制剂，可干扰 mapk 信号通路，抑制表达shp2 的肿瘤细胞增殖。nichols 等报道了shp2 的小分子抑制剂 rmc-4550（30，图 9），其ic 50 为0.583 nmol·l -1 ，可通过抑制kras蛋白的活性阻断ras/erk信号通路和肿瘤生长。shp099（31，图9）也是一种有效的shp2抑制剂。shp099的极性官能团和离子官能团暴露，显著提高了其选择性和口服生物利用度，其对 erk磷酸化的ic 50 为0.07 mmol·l -1。

在抗癌药物研究信号通路筛选中，癌症细胞生长以及侵袭和转移等过程均有 ras/raf/mek/erk通路参与。由于该信号通路负责细胞增殖，因此通过研究小分子抑制剂将期阻断成为重要的研究方向。在ras/raf/mek/erk信号通路中，mapk表达异常是判断癌症发生的标志，目前阻断kras突变肿瘤的策略主要集中在抑制下游mapk信号转导。索拉非尼（sorafenib）（32，图 10）是可口服的、可进行多靶点治疗的kras小分子抑制剂。通过作用于raf/mek/erk/信号通路，其可直接抑制信号转导，从而阻止肿瘤细胞增殖。可比替尼（cobimetinib，gdc - 0973）（33，图 10）是mek/akt双通路抑制剂，该化合物的杂氮环丁烷及酰胺键增加了细胞代谢稳定性，可通过抑制kras g13d和b-raf g464v突变从而抑制肿瘤发生。

布帕利西（buparlisib，bkm120）（34，图10）是一种广谱 pi3k 抑制剂，作用于 p110α，p110β，p110δ 和 p110γ 时，ic 50 值分别为 52，166，116 和262 nmol·l -1 。bez-235（35，图10）是咪唑并喹啉衍生物，是 pi3k 和 mtor 的小分子抑制剂 。利用bez-235对p0α，p0γ，p0δ，p0β和mtor作用时，ic 50 值分别为4，5，7，75 和20.7 nmol·l -1 。另外研究显示，bez-235在临床上可抑制晚期乳腺癌细胞增长，对实体肿瘤也具有治疗作用。bez-235抑制pi3k和mtor突变，阻断pi3k/akt/mtor信号通路，抑制肿瘤细胞抑制肿瘤细胞的恶性增殖。临床证明，该药可维持糖代谢稳定，增强肿瘤细胞对细胞毒性药物如长春新碱等的敏感性。

鸟嘌呤核苷酸交换因子，具有直接和特异性催化gdp/gtp交换能力，从而促进其活性信号状态，减少ral a/b与鸟苷核苷酸亲和能力，有利于结合gtp。ral/gds/ral信号通路负责细胞因子释放，能促进ral蛋白gdp/gtp转换。ral由ral a和ral b亚型组成，ral a对肿瘤生长起重要作用，而ral b在肿瘤转移和侵袭中起重要作用。通过抑制 ral/gds/ral 通路可抑制 ral 下游效应信号通路。研究发现，二氢吡咯环衍生物p61a6（结构未报道）可有效抑制非小细胞肺癌异种移植模型中肿瘤细胞增殖，p61a6对h358，和h1507细胞的ic 50 值为5~15 μmol·l -1。

3 结语与展望

kras蛋白具有独特的结构特点，由于表面相对光滑且口袋腔较浅，与药物分子结合存在一定难度，一度被认为是“不可成药”的靶点。近年来共价抑制剂技术的发展以及对kras结构认识的深入，特别是 amg510 发现以来，直接或间接靶向抑制kras突变的小分子抑制剂相继出现，使kras成为抗癌药物热门研究靶点。国内外已有多家企业聚焦基于kras靶点的创新药开发，申报临床的有十余种，前景值得期待。其中再鼎医药从 mirati公司引进的阿达格拉西布进度较快，的 gf-105、加科思jab-21822、d-1553、贝达药业bpi-421286和恒瑞医药hrs-4642等均已进入临床研究。先声、济民可信的化合物均处在非临床药学研究，细胞增殖抑制活性均达到nmol水平，其他公司的小分子抑制剂也紧随其后，均表现出良好抑制活性。目前，kras小分子抑制剂的研究重心主要是针对 kras g12c。随着研究的深入，针对kras g12d与kras/sos1相互作用的抑制剂及kras降解剂也将不断涌现。同时，目前研究结果显示，kras靶向药物与其他免疫药物或靶向药物联用具有更突出效果，如阿达格拉西布与pd-1抗体潘利珠单抗（pembrolizumab）联用治疗携带kras g12c突变的非小细胞肺癌患者，ⅰ期临床试验结果显示疾病控制率达到100%。此外，protac技术凭借其独特优势将在针对kras靶点的药物开发中发挥出巨大潜力。

因kras突变导致的肿瘤种类较多，从适应证等方面来看，kras是十分值得深入广泛研究的癌症治疗靶点，但目前国内针对该靶点的小分子药物研究同质化严重。就已公布的小分子化合物看，结构差异不大，适应证集中，作用效果相当，这可能导致最终的新药申报、临床选用和市场占有出现十分激烈的竞争。目前 kras g12c 不可逆抑制剂amg510已上市，阿达格拉西布已递交上市申请，二者的ic 50 值在40~100 nmol·l -1 ，临床用药剂量较大，其中后者临床有效剂量为600 mg，amg510＞960 mg，且amg510已出现耐药性。因此，发现活性更高、生物利用度更好的新化合物仍具有重要意义。提高化合物的耐药性也将是 kras抑制剂未来发展的挑战和机遇。