数字pcr：你方唱罢，我方唱 -米乐m6平台

1. 前言

数字pcr（digital pcr，dpcr)是一种核酸分子绝对定量技术，与传统定量pcr（qpcr）技术不同，其不依赖于标准曲线和参照样本，直接检测目标序列的拷贝数，检测极限可达单拷贝，具有更出色的灵敏度、特异性和精确性。

具体而言，数字pcr通过终点检测计算目标序列的拷贝数，无需采用内参和标准曲线即可进行精确的绝对定量检测；数字pcr采用终点检测，不依赖于ct值（循环阈值），所以数字pcr反应受扩增效率的影响降低，对pcr反应抑制物的耐受能力提高，具有很高的准确度和重现性。

理论上，dpcr的反应单元的数目越多（体积越小），数字pcr的灵敏度越高，准确度也越高。根据反应单元的不同形式，主要可分为微板式、微腔式和微滴式三大类系统。

dpcr产业链的中上游主要为仪器、芯片和试剂的研发，具有明显的封闭式特点；产业链的下游根据不同渠道分别对应不同的应用场景。笔者认为，微滴式数字pcr在技术原理、通量和反应单元数等方面均优于微腔式（芯片式），更符合实际应用需求，势必成为数字pcr的主流，但其尚存在技术难点有待突破。

2. 数字pcr：优势明显，应用广泛，市场可期

2.1 反应过程

数字pcr（droplet digital pcr ，ddpcr）通过将样品进行有限稀释，使含有核酸分子的反应体系分成数万个nl级的反应单元，每个反应单元中或含有一个乃至多个待检核酸靶分子（或不含待检核酸靶分子）。之后，数万个反应单元进行独立pcr扩增反应后，对每个反应单元的终点pcr荧光信号进行逐一分析，若含有荧光信号则该微滴判读为“1”（阳性），不含荧光信号则判读为“0”（阴性）。最后，将判读结果利用泊松分布原理进行统计分析，通过读取阳性反应单元的个数及比例从而得出靶分子的起始拷贝数或浓度。（如下图）

数字pcr技术在痕量核酸样本检测、复杂背景下稀有突变检测和表达量微小差异鉴定方面具有极大的优势，从而可以使癌症的液体活检、无创产前筛查、感染性疾病的早期检测等重大医学挑战更加容易实现。

2.2 实际应用

与传统qpcr技术相比，数字pcr技术具有极高的灵敏度、特异性和精确性，基于文献报道资料，其在临床诊断、转基因成分分析、基因表达分析、环境微生物分析和ngs测序验证等研究领域显示出巨大的优势和应用前景。

2.3 市场空间

中国分子诊断市场规模较小，但增长迅速，2014-2017年cagr已达26.9%。若以20%的增速保守预测，中国分子诊断市场将于2020年突破100亿。在分子诊断的主要技术领域中，pcr技术的操作较为简便、快捷，灵敏度较高，同时成本较低，所占份额最大（40%左右）。从临床应用场景来看，和传统pcr一致，数字pcr的市场主要集中于医院的检验科，其次为医院的病理科（或其他科室）和ldt。

然而，数字pcr尚处于发展阶段，在仪器研发、芯片设计、试剂生产、产品注册、临床应用等方面都存在难点与不确定，同时也面临来自ngs产业链上下游的竞争和抵制，其实际能够创造的市场空间有待验证。

3. 技术关键：反应单元生成

对于数字pcr来说，一方面，反应单元的数量对其灵敏度和有效检测范围有很大影响；另一方面，各反应单元所具备的均匀性更好，其能实现的精度也越高。因此，如何快速生成大量、稳定、均一性好的反应单元是数字pcr技术的关键。以下是笔者根据相关文献和公开资料梳理的几种生成方法：

3.1 t型通道法

t型微流控通道包含相互垂直的连续相（油）道和分散相（样品）通道。当样品溶液和油同时经过t型通道时，油会对样品溶液产生挤压，样品被拉长并在分散相出口处产生剪切力，当剪切力大于其表面张力时，样品被剪断，前面部分变为油包水微滴向前流动，后面部分尖端缩回通道末端。不断重复上述过程，就可以不断产生油包水微滴。

3.2 十字通道法（流动聚焦法）

bio-rad公司采用流动聚焦结构产生微滴。芯片共有三个通道，中间通道通入样品溶液，两侧通道通入油，三个通道汇聚于一点。在出口处提供负压使油和样品溶液流动并经过流动聚焦结构，样品溶液在两侧油的挤压和管道结构的作用下断裂成微滴。相较于t型结构，流动聚焦法受力更均匀，微滴一致性更好。

3.3 喷墨法

喷墨法将喷墨印刷技术与微滴生成相结合，使用光刻和化学方法在硅片表面制成由疏水区域包围的亲水点阵列（用于固定微滴）。首先，50μm的喷头和二维移动平台将油滴滴落在亲水点阵列上；其后，30μm喷头在每个油滴上滴入一滴样品微滴；当样品微滴速度足够大时，就可以突破油滴的表面张力，进入油滴内部，形成油包水微滴结构。使用此方法可以生成大量1-10pl的微滴并能够精确排列，并且可以通过改变喷头直径等参数控制微滴的大小。

3.4 阶梯乳化法

中国科学院微生物研究所发明一种可重复使用的微流控芯片，能够基于阶梯乳化（step emulsification）产生纳升液滴阵列，用于同时对8个样品进行片上多重荧光数字pcr。该装置包含两块玻璃板，可实现预先填充矿物油的快速组装。通过由单个压力泵同时驱动8个样品通道的阶梯乳化，利用喷嘴阵列快速产生液滴，生成的液滴在u形腔室中可自组装成单层液滴阵列，每个腔室可容纳约10000个0.35nl体积的微滴。

3.5 界面震动乳化法

该方法设置微管道（分散相）和开口容器（连续相），其中为互不相溶或具有界面反应的两种液体。微管道从开口容器上向下振动运动，使微管道的开口接触并进入连续相中；接着微管道向上振动运动，使分散相脱离微管道，在容器中形成微滴。该微滴生成方法简便，能形成大小可控的微滴，提高大批量液滴生成的精度和效率。

3.6 振动注射法

振动注射技术的核心为特制的加样枪头。枪头浸入油相中，水相反应液匀速排出枪头，在进入油相的过程中，枪头前端进行匀速的摆动，从而产生均一的微液滴。采用振动注射技术，一方面可以通过控制流速，振动频率来灵活调整微滴体积的大小，另一方面该方法可以直接整合到自动化加样工作站流程中，无需昂贵的微流控耗材。

除了上述方法外，还有离心法、y型通道法等方法均可以产生状态稳定、大小均一的反应单元。

4. 国产数字pcr的新势力

国际上，thermo fisher和bio-rad占据主要市场。thermo fisher目前已进入国内市场并与国内企业（南京科维思、天津诺禾致源、北京泛生子）进行oem合作，而bio-rad将以直销模式进入中国市场。与此同时，在数字pcr的仪器自主研发上，国内已有企业实现技术突破，成功推出国产数字pcr仪器。

4.1 小海龟科技

小海龟科技成立于2015年4月，核心团队来自于复旦大学、瑞典uppsala大学、中科院、北京大学、知名医院，有近20年的技术积累和专业经验，通过芯片技术与生命科学技术的融合创新，先后推出国内首款新一代芯片式数字pcr、全球第二款半导体高通量测序仪。

小海龟科技的“biodigital 华 微滴制备仪（biodigital loader）”基于气压自适应调节，结合自动化控制的机械臂及高灵敏光电液位监控系统，并搭配多层柔性生物芯片，在避免样本交叉污染的同时，实现快速、稳定的样本处理。30微升的起始样本于2分钟内可形成2万多个微液滴，有效液滴比例达95%。

4.2 新羿生物

北京新羿生物成立于2015年，在中关村科技园拥有生物医学仪器、耗材和体外诊断试剂生产基地，已申请50项微液滴技术相关专利。据工商信息显示，其于2018年6月刚完成最新一轮融资，投资方为华德资本；前两轮的投资方分别为荷塘投资、庆言投资。

2018年6月，新羿生物推出首款拥有完全自主知识产权的数字pcr系统，有两个突出表现：（1）30微升样本可制备约5万个液滴，提供更高的检测精度和线性范围；（2）独特的防pcr污染芯片结构设计，全过程封闭检测。该系统于2017年10月研发成功，液滴制备仪已备案，检测仪预计2019年获批。（具体产品参数如下表）

4.3 永诺生物

广州永诺生物成立于2010年，总部位于广州国际生物岛，硕、博士以上学历员工占比近40%，已建立包括基因组高通量测序、分子细胞功能实验、病毒包装构建和动物疾病模型等在内的一整套研发、生产技术体系平台。

2017年10月，永诺生物旗下永诺医疗（顺德永诺）成功研发拥有完全自主知识产权的微滴式数字pcr仪microdrop™并投产。该仪器在微管道中利用气压驱动生成十万个微滴，单个微滴体积低至纳升级。目前数字pcr仪器及配套试剂等正在申报医疗器械注册证。（具体产品参数如下表）

4.4 思纳福医疗

思纳福医疗成立于2018年4月，以微液滴技术为根基，开发具有全球自主知识产权的微滴生成方法——振动注射技术（vibrant injection）。其于2019年2月完成a轮融资，由凯风创投和中发展启航基金共同领投，雅惠精准医疗基金跟投。

围绕振动注射技术，思纳福已研发出全自动化数字pcr一体机，能够全自动化实现数字pcr从液滴生成、核酸扩增到最终检测的全流程操作，用户体验与qpcr一致（具体产品参数如下表）。目前一体式数字pcr仪的样机验证和测试工作也已完成，投放测试用样机已经进入生产流程，预计2019年下半年开始推向市场。

除上述公司外，北京达微生物同样致力于研发一体化全自动多重数字pcr，其自主研发的液滴制备技术能够实现耗材低成本、检测精度高，综合性能表现突出。西安天隆科技一直专注pcr仪器和试剂的研发与产业化，其数字pcr研发项目于2019年3月获批国家重大科学仪器设备开发专项。此外，中国科学院微生物研究所杜文斌团队一直致力于国产化数字pcr技术的研制，探索低成本差异化创新策略。

5. 小结

bio-rad的qxdx autodg ddpcr系统于2019年2月获fda批准，成为首个fda批准的数字pcr产品。该ddpcr系统与试剂盒的结合使用可重复、精确地监测慢性粒细胞白血病（cml）患者对治疗的分子反应。这标志数字pcr在临床诊断的应用掀开新的篇章，未来市场将大有可为。

如是，笔者认为：（1）数字pcr替代传统pcr大势所趋，ddpcr大概率会成为数字pcr市场的主流产品；（2）公司的核心壁垒在于自主研发的仪器和试剂，仪器是突破口，试剂是盈利点，二者缺一不可；（3）与传统pcr一致，数字pcr的“主战场”仍为检验科，但目前尚未有产品（系统或试剂）获nmpa批准上市。

参考资料：

1.刘聪,蒋克明,刘聪,周武平,张涛,印晨宇,黎海文.微滴技术的数字pcr研究现状及发展趋势[j].化学研究与应用,2018,30(07):1041-1047.

2.a microfluidic droplet digital pcr for simultaneous detection of pathogenic escherichia coli o157 and listeria monocytogenes[j]. xiaojun bian,fengxiang jing,gang li,xiaoyun fan,chunping jia,hongbo zhou,qinghui jin,jianlong zhao.  biosensors and bioelectronics . 2015

3.digital droplet pcr on disk. schuler f,trotter m,geltman m,et al. lab on a chip . 2016

4.杜文斌,徐鹏,董立兵. 基于微管道的液滴的生成方法:中国, 201410655191.5[p].2016-06-22.

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